RNA干扰/RNAi/基因沉默/siRNA/miRNA
分类: 最上层  发布时间: 2018-03-20 18:56 

RNA干扰/RNAi/基因沉默/siRNA/miRNA
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提供商: 和元上海
服务名称: RNA干扰/RNAi/基因沉默/siRNA/miRNA
RNA干扰技术

服务简介:
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。外源dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。

和元上海根据客户提供的目的基因,针对该基因设计3个siRNA靶点,再将这些靶点构建到腺相关病毒载体,生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。

服务流程:

 

服务优势:

对分裂期细胞和非分裂期细胞均有感染作用

低免疫原性,安全性高

干扰稳定高效

实验周期短

多种载体可选

可供选择的载体:

载体名称 荧光及其他 载体启动子
pAKD-CMV-bGlobin-EGFP-H1-shRNA 带EGFP荧光蛋白 广泛表达的强启动子
pAKD-EF1a-EGFP-H1-shRNA 带EGFP荧光蛋白 广泛表达的启动子,中丰度表达
pAKD-GFAP-EGFP-H1-shRNA 带EGFP荧光蛋白 星形胶质细胞特异性启动子,中丰度表达
pAKD-Syn-EGFP-H1-shRNA 带EGFP荧光蛋白 成熟神经元特异性启动子,中丰度表达
pAKD-CMV-bGlobin-Flex-EGFP-Mir 30-shRNA Cre/loxp调控的开关的基于mir30结构 广泛表达的强启动子
pAKD-CMV-bGlobin-mcherry-H1- CMV-shRNA 带mcherry荧光蛋白 广泛表达的强启动子
pAKD-EF1a-EGFP-H1-shRNA 带EGFP荧光蛋白 广泛表达的启动子,中丰度表达
     
     RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,且具有特异、高效等优点,RNAi已被广泛用于敲减各种基因的表达,具有广阔的应用前景。
     2006年,斯坦福大学的安德鲁·法厄(Andrew Z. Fire)与马萨诸塞大学的克雷格·梅洛(Craig C. Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献而共同获得诺贝尔生理医学奖。
RNAi的作用机制
    化学和遗传学研究表明,RNA干扰包括启动阶段、效应阶段和级联放大阶段三个部分(图1)。
    1. 启动阶段:即RNaseIII家族核酸酶(Dicer酶)与双链RNA结合,并把它酶切成为多段大小为21~25个碱基对的小RNA片段(siRNA),3’端带有2个碱基突出的黏性末端, 5’为磷酸基团,此结构对于 siRNA行使其功能非常关键。Dicer酶具有结合和酶切双链RNA的活性,与双链RNA结合的区域位于Dicer的羧基末端。
    2. 效应阶段:即siRNA与某些作用因子结合形成无活性的RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),该复合物在ATP存在的条件下被激活,siRNA解链,反义链导向RISC与目标RNA互补结合,并酶切目标RNA分子,完成RNA干扰的过程。
    3.级联放大阶段:siRNA能通过细胞内的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用,以RNA干扰起源的双链RNA分子,或者以目标mRNA分子作为模板,合成出新的双链RNA分子,再通过Dicer的加工作用,产生出大量的siRNA,补充细胞内消耗和降解的siRNA分子。这种现象称为siRNA的扩增。
RNAi技术应用的关键点
    为了将RNAi的原理应用于生物技术层面上,必须有适当的方式将外源性的siRNA(small interference RNA)导入到目标生物体内,siRNA一般为19~21个核苷酸大小,在生物体内经过一系列生化路径,引发RNA干扰效果。
图1. RNA干扰作用机制模式图

制备siRNA的方法
    目前针对RNA干扰主要是通过导入化学合成的siRNA或构建shRNA表达克隆的方法进行研究。
    1.化学合成:以人工方式合成所需的siRNA,价格高,定制周期长;
    2.体外转录(载体/反应体系):是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法,比化学合成法更快的得到siRNAs;
    3.用RNaseIII消化长片段双链RNA:选择通常是200-1000个碱基的靶mRNA模板,用体外转录的方法制备长片段双链dsRNA,然后用RNaseIII在体外消化,得到混合有各种siRNA的混合物;
    4.siRNA表达框架(siRNA expression cassette,SECs):是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中,包括一个RNA polⅢ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点;
    5.质粒载体体内转录:将siRNAs通过转染的方式导入细胞;
    6.病毒载体体内转录:将短发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)的病毒载体感染细胞,表达产生shRNA,经过Dicer切割后得到siRNA,此方法可以建立长效基因沉默的细胞株。

设计siRNA载体
    通常选择用质粒作为将siRNA导入细胞的载体,被导入的载体能在生物体内产生类似于miRNA的发夹型siRNA,为了在生物体内合成siRNA,所设计的载体DNA应该包含以下几部分:
    1.同义链(sense strand):与生物体内转录出目标mRNA时所需的基因序列相同;
    2.反义链(antisense strand):与同义链互补配对,转录此序列则可得到与目标mRNA互补的siRNA;
    3.非互补的序列:使得载体经转录后,能形成发夹结构;
    4.其他基因经限制性酶切割的限制部位:如BamH I &Hind III。
设计siRNA序列
    除了选择恰当的siRNA载体外,所需要的siRNA序列需要注意以下几点:
    1.设计使得末端含有5-6个A(T):siRNA载体是由RNA聚合酶III转录而表达,RNA聚合酶III可转录哺乳动物体内大部分的小片段RNA,其特点是:当转录到5-6个腺嘌呤核苷酸A时会停止转录,故导入的siRNA载体经转录后,可得到末端具有5-6个尿嘧啶的siRNA;
    2.选择2-5个目标基因的不同部分序列:生物体内的目标mRNA,可能部分区域被调节蛋白附着,造成RNAi不易进行,故要选择转录出目标mRNA的不同基因片段,才能使得抑制基因表达的效率提升。
RNAi作用的特征
    RNAi是由双链RNA引起的序列特异的转录后基因沉默,即外源基因的转入只对成熟RNA产生作用,对RNA前体没有或很少具有影响,所以含有内含子或启动子序列的外源dsRNA是无法引起RNAi效应的。将外源 dsRNA引入生物体内能特异地抑制有同源序列基因的表达,产生类似于目的位点的无义突变表型。RNAi的效应有以下几个明显特征:
    1.转录后基因沉默:RNAi是转录后水平的基因沉默机制;
    2.特异性高:RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;
    3.效率高:RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;
    4.可穿过细胞界限: RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;
    5.dsRNA不得短于21个碱基:并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割,而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;
    6.ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失,这显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程,可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。

病毒载体在RNA干扰中的应用
    shRNA是根据目的基因的序列设计起干扰作用的正义链和反义链,然后以loop环相连。shRNA通过病毒载体导入细胞,在细胞内可以被剪切成siRNA来发挥干扰效用,其干扰效果等同于siRNA,并且干扰的作用时效要比siRNA的长得多。
慢病毒载体是目前在RNAi的研究中被最广泛使用的病毒载体。慢病毒系统是可以在多种细胞类型中实现基因功能研究的理想工具,它可以同时感染分裂和非分裂细胞,病毒基因组整合到基因组,长时间稳定表达外源基因,可以非常高效地把基因转染到活体模式生物和几乎所有的哺乳动物细胞中,包括难感染的细胞(图2、图3)。

图2. 慢病毒下调海马CA1区P-Rex1 
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. November, 2015)

图3. 慢病毒下调大脑皮层layerI中间神经元connexin 36表达
(Nature Communications. August, 2016)

    腺相关病毒具有可定点整合,携带的外源基因长期持续稳定表达,免疫反应轻微等特性已被广泛应用。利用腺相关病毒结合采用含有特异性启动子的载体立体定位注射,可以实现神经系统的广泛表达和特异表达(图4)。

图4. AAV2/8下调背根神经节神经元FMRP表达
(Cell Reports. December, 2015)

RNAi的应用
    RNA干扰因为可以简化/替代基因敲除,成为研究基因功能的有力工具。
    1.基因功能的研究:RNAi具有高效特异性阻断基因表达的特点,可以进行大规模的基因组筛选。基本原理是针对基因组的不同部分设计相应的dsRNA,构建dsRNA文库,根据蛋白表达的来筛选基因;
    2.基因表达调控:基因功能缺失策略是基因功能研究的重要工具,RNAi转基因小鼠使哺乳动物在整体水平研究基因剔除;
    3. 基因治疗:RNAi被用于治疗因基因表达异常升高而引起的疾病如肿瘤和病毒感染等;
    4.药物筛选:利用RNAi能够特异高效地抑制基因表达,获得去基因功能表型,能够在短时间内大规模筛选靶点,从而实现了在细胞水平和动物水平筛选药靶和评定药靶。

RNAi的脱靶效应
    RNAi过程中,siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实,siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,这种现象称为siRNA脱靶效应(Off-target)。脱靶效应最早是Dharmacon研究人员的Jackson和他的同事们提出的,给细胞转染特定基因的单条siRNA后运用全基因组芯片检测技术鉴定表达上调/下调1.5到3倍的靶基因数量,研究人员发现在这种情况下有大量的基因被非特异性的调控着。多种真核生物中的RNAi实验证实了脱靶效应的存在。
    简单来说,脱靶效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径,通过microRNA途径,其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用,而如果进入microRNA途径,只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果,这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,造成脱靶。如果脱靶干扰的部分基因,正好与目的基因位于同一信号通路中,或者与目的基因的生物学功能相似,那么,如果因脱靶而干扰了其它基因,亦会造成和目的基因受到干扰后相同的细胞表型改变。而实际上,可能选择的这条shRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰,或者虽然干扰了目的基因,但是并不会引起预期的细胞表型改变。
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