神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6
分类: 最上层  发布时间: 2018-03-20 18:56 

神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6
和元生物技术(上海)股份有限公司在发布的神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6供应信息,浏览与神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6相关的产品或在搜索更多与神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6相关的内容。
提供商: 和元上海
服务名称: 神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6

神经元钙离子成像/GCaMP5/GCaMP6

 

钙成像技术(calcium imaging)是指利用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的方法。在神经系统研究方面,在活体(in vivo)或者离体(in vitro)研究中,钙成像技术被广泛应用于同时监测成百上千个神经元内钙离子的变化,从而检测神经元的活动情况。有了钙成像技术,原本悄无声息的神经活动就变成了一幅斑斓闪烁的壮观影像,科学家终于可以亲眼看着神经信号在神经网络之中往来穿梭。因此,这种技术一出现,就受到了全世界神经科学家们的追捧,至今依然是人们观测神经活动最为直接的手段。

钙成像技术的基本原理

在生物有机体内,钙离子产生各种各样的胞内信号,这些胞内信号几乎在每种类型的细胞中都存在,在很多功能方面有重要作用,例如心肌细胞收缩的控制和从细胞增殖到细胞死亡整个细胞周期的调节等。

在哺乳动物的神经系统中,钙离子是一类重要的神经元胞内信号分子。在静息状态下,大部分神经元的胞内钙离子浓度为50-100nM,而当神经元活动的时候,胞内钙离子浓度能上升10-100倍,增加的钙离子对于含有神经递质的突触囊泡的胞吐释放过程必不可少。也就是说神经元的活动与其内部的钙离子浓度密切相关,神经元在放电的时候会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰。

神经元钙成像技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系,利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针(钙离子指示剂,calcium indicator),将神经元中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来,从而达到监测神经元活动的目的。

钙离子指示剂

现在广泛使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂(chemical indicators)和基因编码钙离子指示剂(genetically-encoded indicators)两类:

1.化学性钙离子指示剂:指的是可以螯合钙离子的小分子,所有这些小分子都基于EGTA(乙二醇双四乙酸)的同系物BAPTA(氨基苯乙烷四乙酸),BAPTA能够特意地和钙离子螯合,而不会和镁离子螯合,所以被广泛地用作钙离子螯合剂。现在使用较广泛的化学性钙离子指示剂有:Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。

2.基因编码钙离子指示剂:这些指示剂是来自于绿色荧光蛋白(GFP)及其变异体(例如循环排列GFP,YFP,CFP)的荧光蛋白质,与钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶M13域融合。现在使用较广泛的基因编码钙离子指示剂有:GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch,其中GCaMP6由于它有着超强的敏感度,现在被广泛应用于活体钙成像研究。

钙成像技术在神经科学研究中的可能应用

1.记录培养的神经元的活动。

2.记录脑片上神经元的活动。

3.活体记录神经元的活动。由于离体实验本身的限制,现在越来越多的神经科学家倾向于做活体钙成像实验,希望能得到更准确且更能反应生理状况的数据。得益于双光子荧光显微镜的发展,现在,在实验动物处于活体状态下进行钙成像记录的技术取得了飞速进展。

4.活体记录神经元树突和树突棘(spine)的活动。由于对实验精度的要求,有些科学家不仅仅想记录单个神经元的反应,他们还想更精确地知道神经元上哪些树突和树突棘参与了某个行为,也就是说他们需要在活体条件下,对单根树突以及树突上spine进行钙成像记录实验。由于双光子荧光显微镜和GCaMP6基因编码钙离子指示剂的发展,现在,对树突和树突棘用钙成像实验进行记录也成为了可能。

CaMPARI:瞬间即永恒

传统的钙成像技术受限于显微镜的视野,只能对很小的一片区域进行记录。随着神经科学的进步,人们认识到大脑运作需要借助许多不同脑区的相互协作,要对这些过程进行研究,需要对整个大脑的神经活动进行细致的观测,而传统的钙成像技术在这一方面毫无办法。

另外,由于传统钙成像实验要求成像的光路极为稳定,因此科学家需要把实验动物的脑袋固定起来以方便成像实验。脑袋被固定的实验动物,大脑活动与自由状态下势必存在差别,对科研家而言,这样获得的数据可能还是不够准确。正因如此,神经科学迫切需要一种能够兼顾全局和微观的新型钙成像技术,这就是2015年2月份科学家在著名杂志Science上发表的文章所要解决的问题,他们介绍了一种全新的蛋白CaMPARI(calcium-modulated photoactivatable ratiometric integrator)。

CaMPARI蛋白在正常状态下会发出绿色荧光(green),而如果对这种蛋白同时使用高浓度钙离子与紫外光处理,它就会不可逆、永久地转变成另一种能发出红色荧光(red)的构象,即实现将瞬间的神经元活动变成永久的红色荧光蛋白表达(图1)。

研究人员通过转基因技术将这种新型蛋白导入到实验动物的神经系统中,然后用高强度的紫外光照射动物的大脑,通过检查荧光,找到发红色荧光的神经元,这些神经元即是在紫外光照射期间活跃的神经元。由于紫外光可以对着整个大脑进行照射,所以理论上,人们可以对全脑进行检查。


图1. 在紫外照射期间,一个活跃的神经元(紫红色)和一个不活跃的神经元(绿色)

为了验证CaMPARI的效果,Science文章研究团队分别在斑马鱼、果蝇和小鼠这三类主要的模式动物身上进行了测试。例如,由于斑马鱼的头部完全透明,所以斑马鱼经常被用作为钙成像的模式生物。研究团队通过简单的方法改变斑马鱼的状态,然后通过CaMPARI检测不同状态下斑马鱼脑部的神经活动。结果显示CaMPARI可以良好地反应斑马鱼脑部的神经活动,比如在麻醉状态下,斑马鱼神经元的活动因为受到抑制而表现出一片绿色,而当有药物诱导癫痫的状态下,神经元的广泛异常放电导致红色荧光蛋白的表达异常丰富(图2)。


图2. 在斑马鱼身上验证CaMPARI蛋白的效果,结果显示CaMPARI可以很好地反应斑马鱼的神经活动
 

Science文章第一作者孙一指出:作为一种快速灵敏的神经活性标记技术,CaMPARI可能在脑功能图谱和连接组学的研究方面有着重要且广泛的应用价值。

其他相关应用

光遗传     化学遗传     神经环路示踪    钙离子成像     CRISPR/Cas9

Cre-LoxP     RNA干扰     基因过表达     microRNA表达    microRNA抑制

上一产品
下一产品