「Science 重磅」强千倍!全新萤光素酶让深层组织单细胞成像不再是梦
来源:    发布时间: 2018-03-14 09:38   158 次浏览   大小:  16px  14px  12px
 生物发光(

 
生物发光(bioluminescence),是指生物体或生物体提取物发光的现象。它是一种特殊类型的化学发光,不依赖于生物体的光吸收。生物发光的机制是:由细胞合成的化学物质,在一种特殊酶的作用下,其化学能转化为光能。

在生物世界里说到发光,人们首先会想到萤火虫。和大多数生物发光相似,萤火虫的发光依赖于萤光素(D-luciferin)和萤光素酶(luciferase)两种物质。活体生物发光成像(BLI)技术是一种无创分析生物体肿瘤细胞移植和检测神经元活性的方法,其最广泛使用的萤光素即 D-luciferin。然而,D-luciferin 具有组织穿透性低、酶亲和力低以及血脑屏障通透性差等缺点,为此技术带来了很大的局限性。


近年来,科研工作者人工合成了 AkaLumine-HCl 等多种。在萤火虫萤光素酶(Fluc)的作用下,AkaLumine-HCl 会释放 677nm 近红外光,组织通透性强。此外,AkaLumine-HCl 在机体内主要分布在肺脏等深部器官当中,这些器官正是 Fluc 的高表达区域。但是,Fluc 的酶亲和力不高,因此并不是 AkaLumine-HCl 的最优萤光素酶。

2018 年 2 月 23 日,Science 刊登了 RIKEN 脑科学研究所 A.Miyawaki 研究组的最新重要工作 [1],他们开发了一种新型萤光素酶,使萤光素 AkaLumine-HCl 的荧光强度提升了 100-1000 倍,在小鼠和灵长类动物中实现了深部组织发光可视化,极大推动了生物发光成像领域的发展。
 

结果

1、AkaLumine 和 D-luciferin 发光成像的对比

首先,作者通过突变体筛选方法,开发出一种新型萤光素酶——Akaluc。接下来,作者通过 cDNA 转染的方式,在 Hela 细胞中表达 Akaluc 或 Fluc,得到 Hela/Akaluc 和 Hela/Fluc 细胞株。他们发现 Akaluc 的表达水平是 Fluc 的 4 倍,催化活性是 Fluc 的 7-13 倍。

然后,作者希望在体对比 2 种萤光素/萤光素酶的发光成像水平。他们提前在小鼠体内注射饱和剂量的 AkaLumine-HCl 或 D-luciferin,并在尾静脉中注射 Hela/Akaluc 或 Hela/Fluc 细胞,发现小鼠肺部 AkaLumine-HCl/Akaluc 的发光信号是 D-luciferin/Fluc 的 52 倍;他们又在小鼠的纹状体中注射 AAV 来表达 Akaluc 或 Fluc,发现 AkaLumine-HCl/Akaluc 的发光信号是 D-luciferin/Fluc 的 1408 倍(图 1)。

这些结果表明,无论体外还是在体,AkaLumine-HCl/Akaluc 系统的生物发光效率显著高于 D-luciferin/Fluc 系统。在后文中,我们用 AkaBLI 来表示 AkaLumine-HCl/Akaluc 系统。

图 1 人工合成萤光素 AkaLumine 和天然萤光素 D-luciferin 发光成像对比

2、AkaBLI 系统定量分析 Hela 细胞的肺部移植效率

由于 Hela/Akaluc 细胞的生物发光信号很强,作者将 AkaBLI 用作定量方法来研究 Hela 细胞在小鼠肺部的移植效率。他们在 12 只小鼠的尾静脉中分别注射含 1 个 Hela/Akaluc 细胞的溶液,发现只有 2 只小鼠的肺部有发光信号。若注射含 2 个细胞的溶液,5/9 的小鼠肺部有发光信号;若注射含 3 个细胞的溶液,9/10 的小鼠肺部有发光信号。上述信号均为单焦点信号。而当注射含 10 个细胞的溶液时,4/6 的小鼠肺部有单焦点发光信号,1/6 小鼠的肺部呈现出双焦点信号。光信号总强度和注射细胞的数量线性相关(图 2)。

这些结果表明,Hela 细胞很可能在移植进入肺部之前就聚集成群,而且集群越大,移植进入肺部的概率越高。这些结论与过去的研究结果一致。

图 2 AkaBLI 系统定量分析 Hela/Akaluc 细胞的肺部移植效率

3、AkaBLI 系统无创检测小鼠大脑海马 CA1 的活性

接下来,作者将 AkaBLI 发光成像技术应用于神经科学。他们在 c-fos tTA 小鼠的海马 CA1 中注射 AAV-TRE-Venus-Akaluc,只有表达 c-fos 的神经元(被激活的神经元)才能表达 Venus-Akaluc 萤光素酶。过去的研究表明,探索新奇环境会激活小鼠海马 CA1 神经元。在此实验中,作者发现小鼠探索新奇环境 7 小时之后,其 CA1 区域的发光信号显著增强(图 3),表明 AkaBLI 可以无创高效检测大脑神经元活性。

图 3 AkaBLI 系统无创检测小鼠大脑海马 CA1 的活性

4、AkaBLI 系统在狨猴大脑纹状体中的成像

在啮齿动物中验证 AkaBLI 之后,作者希望在更高级的灵长类动物中使用 AkaBLI 系统长时间检测神经元活性。他们在一只 4 岁雌性狨猴的右侧纹状体中注射 AAV 来表达 Akaluc,腹腔注射 AkaLumine-HCl 后麻醉狨猴并成像,每个月 1 次。他们发现,腹腔注射后第 3 个月,纹状体发光信号明显增强,并可持续数月。注射后 1 年,依然可以检测到自由活动狨猴的发光信号(图 4)。这些结果表明 AkaBLI 系统非常稳定、持久,并可应用于灵长类动物。

图 4 AkaBLI 系统在狨猴大脑纹状体中的成像

总结

生物发光成像技术应用广泛,而其必需的萤光素有很大局限性。天然萤光素 D-luciferin 组织穿透性低、酶亲和力低、血脑屏障通透性差,人工合成萤光素 AkaLumine 找不到对应的生物酶。

本篇重要文章开发了一种新型萤光素酶,使 AkaLumine 的荧光强度提升了 100-1000 倍,进而组成 AkaBLI 系统。该系统可以在多种动物中无创定量分析肿瘤移植以及长时程检测神经元活性,有极大潜力推动医学、药理学以及神经科学的发展!

和元上海一直关注神经科学领域的重大研究进展,为神经生理、病理研究提供最新工具和研究方案,助力临床转化和基因治疗!


参考文献

1.Iwano,S., et al., Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science, 2018. 359(6378): p. 935-939.